Élastographie de cohérence optique des vibrations ambiantes débiaisées pour profiler les propriétés mécaniques des cellules, des organoïdes et des tissus

May 23, 2023

Communications Biology volume 6, Article number: 543 (2023) Citer cet article

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Le rôle de l'environnement mécanique dans la définition de la fonction, du développement et de la croissance des tissus s'est avéré fondamental. L'évaluation des changements de rigidité des matrices tissulaires à plusieurs échelles repose principalement sur des équipements invasifs et souvent spécialisés tels que l'AFM ou des dispositifs de test mécaniques mal adaptés au flux de travail de la culture cellulaire. Dans cet article, nous avons développé une méthode d'élastographie par cohérence optique passive impartiale , exploitant les vibrations ambiantes dans l'échantillon qui permet un profilage quantitatif non invasif en temps réel des cellules et des tissus. Nous démontrons une méthode robuste qui découple la diffusion optique et les propriétés mécaniques en compensant activement le biais de bruit associé à la diffusion et en réduisant la variance. L'efficacité de la méthode pour récupérer la vérité terrain est validée in silico et in vitro, et illustrée pour des applications clés telles que le profilage mécanique de l'évolution temporelle des sphéroïdes osseux et cartilagineux, les modèles de cancer d'ingénierie tissulaire, les modèles de réparation tissulaire et la cellule unique. Notre méthode est facilement implémentable avec n'importe quel système commercial de tomographie par cohérence optique sans aucune modification matérielle, et offre ainsi une percée dans l'évaluation mécanique des tissus en ligne des propriétés mécaniques spatiales pour les organoïdes, les tissus mous et l'ingénierie tissulaire.

Il a été démontré que l'environnement mécanique dans l'homéostasie tissulaire est fondamental pour la fonction, le développement et la pathologie de plusieurs organes1,2,3. La rigidité de la matrice peut être un indicateur informatif dans de nombreuses applications biologiques et médicales. En génie tissulaire, les propriétés mécaniques volumineuses et spatiales des greffons modifiés sont cruciales pour leur succès clinique après implantation4,5,6,7. Par exemple, la limitation des nutriments peut créer une région centrale plus molle dans le cartilage artificiel8,9. Dans la recherche sur le cancer, la rigidité différencie les tissus malins des tissus sains10, et la surveillance du changement de rigidité du modèle de cellules cancéreuses 3D en réponse au traitement médicamenteux anticancéreux peut potentiellement indiquer l'efficacité du médicament11. Au niveau de l'œil, la raideur de la cornée est révélatrice de ses performances optiques sous pression intraoculaire12. Les approches traditionnelles pour tester les propriétés mécaniques des tissus modifiés nécessitent généralement un contact direct avec le tissu et sont non stériles, impliquant l'arrêt de la culture cellulaire13,14. En outre, il ne fournit que des valeurs globales plutôt qu'un aperçu localisé de l'hétérogénéité mécanique spatiale du tissu d'ingénierie. La fabrication ou les cultures à long terme nécessitent une surveillance continue facile sans endommager les cultures 3D et les systèmes optiques offrent une solution potentielle. Par conséquent, un système est nécessaire pour la surveillance en ligne stérile des propriétés mécaniques globales et spatiales des tissus 3D in vitro tels que les matrices ensemencées de cellules, les organoïdes ou les explants ex vivo.

La quantification et la cartographie spatiale de la rigidité, un processus connu sous le nom d'élastographie, peuvent généralement être effectuées en stimulant un spécimen, en mesurant sa déformation et en déduisant ses propriétés mécaniques par ajustement à un modèle paramétré. L'élastographie a d'abord été mise en œuvre avec l'imagerie ultrasonore15, puis l'IRM16 et plus récemment avec des méthodes optiques comme récemment revues17. La tomographie par cohérence optique (OCT)18 est particulièrement bien adaptée au suivi de la déformation par élastographie dans de petits échantillons, en raison de sa capacité d'imagerie 3D non invasive à haute résolution19 et de sa capacité à coder avec précision le déplacement tout au long de sa phase20.

Les premières méthodes d'élastographie par cohérence optique (OCE) utilisaient la compression de surface avec suivi du chatoiement21,22 et la mesure ultérieure du décalage de phase23, ​​mais le concept a été réalisé avec de nombreuses autres formes de stimulation avec et sans contact24. Une approche réussie consiste à lancer des ondes de cisaillement contrôlées dans le matériau à partir d'un chargement dynamique ponctuel via une bouffée d'air25 et à mesurer la vitesse d'onde résolue dans l'espace à l'aide de l'OCT, qui est étroitement liée à la rigidité du matériau26 et a été démontrée in vivo27. Les ondes de cisaillement diffuses à large bande naturelles peuvent également être exploitées pour mesurer la longueur d'onde de cisaillement28,29, un concept utilisé par Nguyen et al.30 avec OCT où il est appelé « élastographie passive ». Une approche étroitement liée de Zvietcovich et al.31 mesure la longueur d'onde de cisaillement des ondes réverbérantes à partir d'un ensemble de sources ponctuelles de contact vibrant à une seule fréquence, où elle a été appliquée avec succès ex-vitro pour quantifier la rigidité de la cornée.

L'élastographie passive est une technique convaincante pour le contraste mécanique, car elle peut être réalisée avec des systèmes OCT sans modifications matérielles supplémentaires. Sans besoin de contact avec les matériaux, l'analyse peut être effectuée de manière stérile pour les applications d'ingénierie tissulaire. Bien que l'acquisition soit à la fois asynchrone et lente par rapport à la source vibrante, permettant l'utilisation de capteurs à faible trame, on peut toujours estimer la longueur d'onde de cisaillement à partir d'une série de champs de déplacement en utilisant l'algorithme d'ajustement de Bessel à corrélation croisée de réf. 31 ou rapport d'énergie déplacement/déformation de réf. 30. Cependant, alors que le premier a une résolution spatiale limitée dans tout le plan d'ajustement, le second est intrinsèquement biaisé par des niveaux de bruit variables. Par conséquent, nous proposons une analyse notée vibrations ambiantes débiaisées OCE pour former une estimation spatialement variable débiaisée de la longueur d'onde locale, qui convient aux matériaux de différentes tailles et propriétés de diffusion optique.

Nous avons d'abord simulé une onde de cisaillement se déplaçant dans un matériau biphasique selon l'équation. (4) (Fig. 1a) avec une longueur d'onde de λ1 = 2 mm dans la région bleue et λ2 = 4 mm dans la région jaune, et testé les performances de notre algorithme pour récupérer la vérité terrain avec une acquisition lente et asynchrone par rapport à la source vibrante. Les mesures de phase en accéléré (N = 195) correspondant au champ de déplacement induit par l'onde de cisaillement se déplaçant dans le matériau (plan x – y) sont simulées sur la figure 1b avec un bruit gaussien blanc additif (variance σ = 0, 05), et utilisé comme entrées des algorithmes OCE estimant la longueur d'onde le long de l'axe x (Fig. 1c). L'algorithme OCE passif tel que présenté dans la réf. 30 est biaisé par le bruit dans les mesures, ce que nous montrons théoriquement. Cet effet est démontré sur la figure 1c et étudié plus en détail avec une variance de niveau de bruit différente sur la figure 1d. Comme le bruit dans les estimations de déplacement de l'OCT est lié à son rapport signal sur bruit32,33, ce contraste d'élastographie passive est directement lié aux propriétés de diffusion du matériau. Par conséquent, les matériaux ayant une rigidité identique mais une diffusion optique différente seront différenciés de manière incorrecte avec cet algorithme. Pour atténuer ce problème, nous présentons une approche qui compense activement ce biais de bruit et réduit la variance par filtrage spatial. L'efficacité de ceci est démontrée dans les cartes de longueur d'onde de la Fig. 1a et les profils de ligne de la Fig. 1c. L'estimation sans biais corrige l'erreur moyenne, mais introduit une grande quantité de variance, attribuée au compromis biais-variance. Enfin, notre algorithme OCE de vibration ambiante débiaisé proposé produit une estimation de faible variance débiaisée très proche de la vérité terrain. Plus important encore, les tendances sont cohérentes pour différents niveaux de bruit sur la figure 1d, ce qui permet le découplage de l'intensité de diffusion et du contraste mécanique.

a Montre la vérité terrain avec des ondes se déplaçant latéralement dans un matériau biphasique à la longueur d'onde λ1 = 2 mm et λ2 = 4 mm, l'estimation biaisée de l'élastographie passive selon l'Eq. (6)29, l'estimation débiaisée à variance élevée de l'Eq. (8) et l'estimation filtrée débiaisée proposée de l'Eq. (9), qui forme le contraste mécanique. Les longueurs d'onde sont codées par couleur dans la figure selon la barre de couleur. b Montre la mesure de phase accélérée simulée induite par le champ de déplacement calculé à partir de la vérité terrain avec l'ajout d'un fond bruité. c Affiche les profils de ligne à travers les régions colorées dans a. Le panneau d est le biais de longueur d'onde estimé pour l'élastographie passive (toutes les lignes rouges) et les vibrations ambiantes débiaisées OCE (lignes bleues) à des niveaux de bruit croissants.

La mesure fiable de la longueur d'onde élastique permet alors de produire une estimation de la raideur. Pour les matériaux isotropes linéairement élastiques par exemple, E ∝ λ2, où E est le module de Young et λ est la longueur d'onde estimée par notre algorithme. Grâce à l'étalonnage et aux mesures dans les mêmes conditions, la constante de proportionnalité peut être trouvée. Plus de détails sur la relation entre la longueur d'onde et les modules élastiques sont résumés ci-dessous.

Nous avons ensuite validé notre approche avec des gels d'agarose acellulaire de rigidité variable, qui est résumée à la Fig. 2, avec des détails de mise en œuvre et de traitement et un protocole expérimental entièrement décrit dans «Méthodes». Après imagerie OCT, le module de Young de ces gels a été mesuré à l'aide d'un test de compression standard. Les images d'intensité OCT et les cartes de contraste mécanique calculées de ces hydrogels sont présentées à la Fig. 2a. Tous les gels avaient la même quantité d'agent de contraste optique mais une concentration différente d'agarose, qui s'est avérée en corrélation avec sa rigidité34, pour découpler la diffusion optique et les propriétés mécaniques. Il y a une augmentation visible de l'estimation de la rigidité avec l'augmentation de la concentration à partir des cartes λ. Comparé au module de Young des groupes de chaque concentration de gel (n = 3), comme le montre la Fig. 2c, il existe une forte corrélation linéaire (r = 0,994) validant le modèle E ∝ λ2 pour ce matériau. Nous nous référerons désormais à la longueur d'onde moyenne au carré, λ2, en tant que "rigidité relative".

a Montre des exemples d'intensité et de contraste mécanique. Toutes les images ont une taille de 3 × 3 mm. Le panneau b est un profil de ligne de bord et une résolution spatiale tels que calculés comme le FWHM de la dérivée sigmoïde ajustée comme dans l'équation. (13); la résolution spatiale du bord axial correspondant s'est avérée être de 38,1 μm. c Étalonnage mécanique effectué comme un ajustement linéaire entre la longueur d'onde au carré et le module de Young de Bose ElectroForce (n = 3), en supposant le modèle élastique dans l'Eq. (3); Les barres d'erreurs montre les déviations standards. Les images d'intensité OCT sont affichées sous forme de logarithme de l'intensité moyenne.

L'agarose hybride illustré à la Fig. 2a montre la capacité de mesurer la rigidité hétérogène et les variations locales, similaires à celles de la réf. 30. Dans ce cas, notre algorithme produit un contraste net entre les deux moitiés du gel et cohérent avec la profondeur. Enfin, nous avons estimé que la résolution spatiale de notre méthode et de notre système à partir des transitions de bord, avec le profil correspondant sur la figure 2b, était de 47, 4 μm latéralement et de 38, 1 μm axialement, comparable à celle rapportée par la réf. 31; la méthode de calcul de la résolution spatiale est détaillée dans la section Méthodes. Sans débiaisation, l'élastographie passive peut également fournir un contraste mécanique similaire, comme indiqué dans la réf. 30. Cependant la mesure quantitative de la longueur d'onde de cisaillement est largement sous-estimée (voir Figs. 1c et S2d) surtout en présence de bruit (Fig. 1d). En revanche, les vibrations ambiantes débiaisées OCE fournissent une valeur précise de la longueur d'onde dans la simulation (Fig. 1c), même en présence de bruit (Fig. 1d), et une valeur réaliste de la longueur d'onde pour des échantillons réels qui correspond bien aux mesures mécaniques. (voir figure 2c).

L'analyse de la rigidité matricielle lors de l'ingénierie tissulaire orthopédique est essentielle à l'évaluation et potentiellement aux mesures des résultats pour la fabrication d'implants médicaux. En tant qu'application de l'analyse OCE des vibrations ambiantes débiaisées dans l'ingénierie des tissus osseux, nous avons cultivé des pastilles de cellules souches mésenchymateuses (CSM) en différenciation ostéogénique pendant 21 jours, tout en mesurant en continu leur rigidité avec des vibrations ambiantes débiaisées OCE de manière stérile en ligne. La validation a été effectuée sur un sous-ensemble d'échantillons avec des tests mécaniques au point final. D'après les tests mécaniques, illustrés à la Fig. 3b, il y a une augmentation marquée du module de Young des tissus osseux modifiés tout au long de la culture. Cette augmentation du contraste mécanique est également claire dans les cartes λ de la figure 3a dans chacune des pastilles au fil du temps. La rigidité relative de la vibration ambiante débiaisée OCE a ensuite été quantifiée sur chacune des pastilles et illustrée à la Fig. 3c, montrant une augmentation monotone sur la culture pour chaque échantillon, conformément aux données des tests mécaniques. Une coloration accrue du collagène dans les pastilles ostéogéniques a été observée avec le temps de culture, indiquant la croissance du contenu de la matrice lors de la culture, étayant davantage les données des tests mécaniques et l'analyse OCT. Des hétérogénéités spatiales ont été observées dans les cartes de contraste mécanique et l'histologie.

Le panneau a est des exemples d'intensité et de contraste mécanique des tissus osseux modifiés (en triple exemplaire) aux jours 3, 10 et 21. Toutes les images présentées sont de 1 × 1 mm. b Montre le module de Young du tissu, testé par un appareil de compression personnalisé (n = 4)40. Le panneau c est la rigidité relative pour chaque échantillon tout au long de la culture (n = 3). d Histologie avec coloration au rouge picrosirius pour la teneur en collagène des pastilles ostéogéniques aux jours 3, 10 et 21. La coloration orange indique le cytoplasme et la coloration rouge indique de nouvelles fibrilles de collagène synthétisées ; barre d'échelle : 100 µm. e Montre l'intensité et le contraste mécanique des tissus cartilagineux modifiés stimulés par la pression hydrostatique pendant 21 jours. Le panneau f est la teneur en glycosaminoglycanes (GAG) des échantillons (n ​​= 4), et g montre la rigidité relative de l'analyse OCE des vibrations ambiantes débiaisées (n = 3). * indique une différence significative avec ap < 0,05 et ** de p < 0,01 tel que calculé avec le test Anova à 1 facteur suivi d'une comparaison des moyennes de Tukey-Kramer. Les barres d'erreur représentent l'écart-type.

Ensuite, nous avons appliqué une analyse OCE de vibration ambiante débiaisée à des culots cellulaires MSC cultivés dans un milieu chondrogénique pendant 21 jours. N = 3 échantillons ont été soumis à une pression hydrostatique pour améliorer encore la différenciation, tandis que le reste (N = 3) a été conservé comme témoin. Comme prévu, l'analyse biochimique a montré une augmentation de la teneur en glycosaminoglycanes (GAG) dans le groupe stimulé, comme le montre la figure 3f, impliquant une augmentation de la rigidité, ce qui se reflète bien à la fois dans les cartes λ de la figure 3e et dans l'analyse quantitative résumée. sur la figure 3g.

Nous avons exploré le potentiel des vibrations ambiantes débiaisées OCE dans la recherche sur le cancer pour surveiller les propriétés mécaniques spatiales d'un modèle de cancer issu de l'ingénierie tissulaire. Nous avons d'abord cultivé des gels de collagène ensemencés de fibroblastes pendant 11 jours. Comme prévu, notre analyse a montré une augmentation constante de la rigidité relative du gel de collagène ensemencé de fibroblastes au moment de la culture Fig. 4a, b. Ensuite, des cellules cancéreuses de l'ovaire ont été ensemencées sur le gel de collagène pendant 7 jours et pouvaient facilement être distinguées de la couche de gel de collagène en analysant le contraste mécanique entre les deux Fig. 4c, d. Ceci a été soutenu par l'histologie (Fig. 4e, f).

a Montre l'intensité et le contraste mécanique des gels de collagène ensemencés de fibroblastes sur une culture de 11 jours. Toutes les images présentées sont au format 6×3 mm. b Montre leur rigidité correspondante dans le temps. c Montre l'intensité et le contraste mécanique des gels de collagène avec et sans cellules cancéreuses cultivées sur le dessus pendant 7 jours. d Propriétés mécaniques mesurées le long de la ligne rouge affichée en c. e, f Images histologiques pour c colorées à l'hématoxyline et à l'éosine. Barre d'échelle : 1 mm.

L'OCT est un outil de routine en ophtalmologie et notre méthode pourrait étendre ces capacités au suivi de routine des reconstructions de surface. Ainsi, nous avons étudié le potentiel des vibrations ambiantes débiaisées OCE pour évaluer la qualité et l'efficacité d'un système de gel pour réparer les petites lésions de la cornée. Des cornées porcines (N = 3) ont été prélevées par biopsie pour générer une plaie locale. Ensuite, une solution de 15% ou 20% de solution de fibroïne de soie méthacrylée a été injectée sur le site de la blessure, réticulée aux UV et imagée avec OCT (Fig. 5a). L'analyse OCE des vibrations ambiantes débiaisées a montré une rigidité relative significativement plus élevée dans le groupe de gel à 20%, ce qui est conforme aux données mécaniques obtenues par les tests de rhéologie (Fig. 5b, c). Alors que les images d'intensité OCT n'ont montré aucun vide évident à l'interface entre le gel et la cornée dans les deux groupes, des vides clairs ont été identifiés pour les deux groupes sur la carte de contraste mécanique (λ) (voir flèches blanches), indiquant l'existence d'une solution de gel non polymérisée. . Cela suggère que les vibrations ambiantes débiaisées OCE peuvent être un outil puissant pour évaluer la qualité et l'efficacité de la réparation tissulaire.

a Montre l'intensité et le contraste mécanique des cornées porcines intactes et après implantation de deux concentrations différentes d'hydrogel ; les flèches blanches indiquent les zones de gel non durci, qui présentent un contraste mécanique élevé mais pas en intensité. b Affiche le module de stockage de la rhéologie à partir d'échantillons d'hydrogel (n = 3). c Montre la rigidité relative des scans OCT (n = 3). d Montre une étude sur les propriétés mécaniques des ovocytes de souris : comparant les ovocytes de type sauvage intacts et sans zona et les ovocytes knock-out intacts de l'histone H3.3 ; les ovocytes de type sauvage intacts de la zone présentent une plus grande hétérogénéité de rigidité nettement différente de l'inactivation H3.3 sans zone et moins compétente pour le développement. Les images d'ovocytes ont été recadrées à 100 × 300 micromètres (x – z). * indique une différence significative avec ap < 0,05 et ** de p < 0,01 tel que calculé avec le test Anova à 1 facteur suivi d'une comparaison des moyennes de Tukey-Kramer. Les barres d'erreur représentent l'écart-type.

Les études de fertilité de routine peuvent impliquer l'évaluation de la viabilité et de la compétence développementale des ovocytes pré-fécondés. Des études récentes suggèrent que la rigidité de l'ovocyte est associée à sa viabilité et à son potentiel de développement embryonnaire35. L'application de l'analyse OCE des vibrations ambiantes débiaisées aux ovocytes de souris est résumée à la figure 5d. Nous avons comparé des ovocytes intacts et dépourvus de zone pellucide de souris de type sauvage et l'inactivation de Cabin1, qui s'est avérée provoquer un arrêt du développement embryonnaire36. Premièrement, une différence significative de la longueur d'onde moyenne a été observée par rapport au groupe témoin, ce qui pourrait être un moyen d'évaluer leur viabilité comme dans les références. 35,37. La carte de contraste mécanique a montré un anneau externe plus rigide dans la zone intacte de type sauvage par rapport aux souris knock-out cabine1 sans zone et à zone intacte (Fig. 5d). Cela suggère que la vibration ambiante débiaisée OCE peut être un outil efficace pour le dépistage sans contact des ovocytes compétents pour le développement de manière non invasive, contrairement à l'aspiration par micropipette34.

L'analyse des vibrations ambiantes débiaisées est un algorithme de post-traitement permettant de dériver des cartes de contraste mécaniques quantitatives à partir d'analyses OCT, qui découple les propriétés de diffusion et mécaniques. L'approche est basée sur l'estimation de la longueur d'onde des ondes élastiques ambiantes qui sont générées par plusieurs sources dans des conditions de laboratoire. Dans les laboratoires de recherche optique, il est généralement nécessaire de mener des expériences dans un environnement exempt de vibrations. Cependant, une foule de sources de vibrations proches et éloignées telles que le chauffage, la ventilation, la climatisation, les incubateurs, les pompes, les ordinateurs, les équipements scientifiques, les systèmes de transport routier et ferroviaire s'ajoutent dans un bruit de fond vibratoire inévitable qui est couplé à l'environnement environnant. À cette fin, les systèmes optiques sont construits sur des tables de vibration passives ou actives spécialisées. Cependant, dans notre étude, nous avons intentionnellement fait fonctionner notre système OCT sur un banc pour bénéficier pleinement des vibrations ambiantes.

De plus, nous avons effectué une analyse FEM pour montrer que les vibrations externes appliquées à une plaque à puits génèrent suffisamment d'ondes dans l'échantillon. Il convient également de noter que dans notre configuration expérimentale, nous devons prendre des mesures pour réduire l'ampleur des vibrations environnementales en plaçant la plaque dans une chambre avec une base en caoutchouc pour éviter l'emballage de phase et les artefacts déclenchés par de grands déplacements.

Les vibrations ambiantes sont également pertinentes pour les études in vivo, car les ondes de cisaillement résultant naturellement de l'activité du corps humain ont été utilisées pour évaluer qualitativement les propriétés élastiques des tissus28,38.

De plus, le potentiel de l'élastographie par cohérence optique passive in vivo a également été démontré pour une cornée de rat anesthésiée30.

La résolution spatiale est une considération importante pour toute méthode d'imagerie, et la capacité de résoudre différentes rigidités de matériaux est un avantage principal de l'OCE. Théoriquement, notre méthode n'est limitée que par le nombre de pixels sur lesquels la puissance de déformation est calculée ou le noyau du filtre. Pour l'étude sur l'agarose de la Fig. 2, nous calculons la déformation latéralement avec une fenêtre glissante de 7 pixels et utilisons un filtre gaussien avec un écart type spatial de 5 pixels, conduisant à une FWHM de 11,8 pixels et une résolution spatiale attendue de 41,3 μm latéralement et 20,9 μm axialement, ce qui est comparable aux 47,4 μm et 38,1 μm que nous avons mesurés empiriquement à partir de la transition du bord. En présence de bruit, il existe un compromis entre biais, résolution spatiale et variance qui peut être contrôlé par les paramètres Ng et Nh. Plus le bruit est élevé, plus la résolution spatiale réalisable est faible pour une précision donnée, de sorte que le niveau de diffusion optique est important pour un SNR élevé, tout en n'atténuant pas le signal et en réduisant la pénétration. Enfin, nous appelons la longueur d'onde moyenne la rigidité relative, en négligeant la viscoélasticité. Ceci a été motivé par le fait que dans les tissus mous incompressibles, le comportement élastique est dominé par le module de cisaillement qui varie linéairement avec le carré de la longueur d'onde de l'onde de cisaillement couramment utilisée en élastographie passive30. Nos données expérimentales (Fig. 2c), montrant une forte dépendance linéaire (r = 0, 994) entre le module de Young mesuré et le carré de la longueur d'onde de l'onde de cisaillement, ont validé que le comportement viscoélastique pouvait être négligé dans cette approximation. Dans notre étude, nous avons validé l'approche en utilisant des exemples courants où la rigidité est une évaluation de base lors de l'évaluation de la culture ou des résultats. Nos résultats ont montré comment nous pouvons évaluer les tissus orthopédiques tels que le cartilage et l'os pendant la différenciation dans les tissus intacts, les modèles de cancer issus de l'ingénierie tissulaire, l'évaluation de la fertilité des ovocytes in vitro et les applications ophtalmologiques où l'évaluation peut être faite de la rigidité du biomatériau avec le temps suivant l'implantation.

Vibrations ambiantes débiaisées OCE est un outil puissant pour évaluer spatialement les biomatériaux et les biomatrices in vitro en culture 3D, car il produit une image de contraste mécanique quantitative, ou λ-map, qui est découplée de l'image d'intensité de diffusion standard de l'OCT, et cette information supplémentaire peut être utilisé pour indiquer des changements importants dans l'échantillon. De plus, on peut extraire la «rigidité relative» d'une région comme la longueur d'onde moyenne au carré, qui sera directement proportionnelle au module de Young d'un matériau élastique linéairement isotrope, tel que validé dans des échantillons d'agarose. En utilisant des systèmes biologiques aux propriétés matricielles variables, nous montrons que cette approche efficace et « simple à utiliser » offre une percée dans l'évaluation mécanique des tissus en ligne des propriétés mécaniques spatiales pour les organoïdes, les tissus mous et l'ingénierie tissulaire.

Le système utilisé pour l'étude des pastilles d'agarose et de hMSC était un système OCT à domaine spectral Thorlabs Telesto-II avec une longueur d'onde de source centrale de 1310 nm équipé d'une lentille de balayage (LSM03 Thorlabs) résultant en une résolution axiale de 4,1 μm dans le tissu et une résolution latérale de 15 micromètres. L'acquisition consistait en 192 trames, chacune avec 1000 A-scans à une fréquence de 48 kHz. Dans le cas des gels de collagène ensemencés d'ovocytes et de cancers, le système était un système Wasatch Photonics 800 nm avec une bande passante spectrale de 92 nm, avec des mesures consistant en 100 trames de 512 A-scans à une fréquence de 30 kHz. Dans tous les cas, les échantillons ont été placés dans des plaques à puits de culture tissulaire standard sur le même banc que la sonde OCT pour permettre la transmission des vibrations.

Le prétraitement a été effectué avec un logiciel sur mesure pour : rééchantillonner le spectromètre dans l'espace k, supprimer le signal de fond et prendre la transformée de Fourier rapide pour la mapper dans un espace de retard à valeur complexe. Les champs de déplacement entre les trames suivantes ont ensuite été estimés avec

où λ0 est la longueur d'onde centrale de la source, neff est l'indice de réfraction effectif de l'échantillon, ℜ et ℑ prennent les parties réelles et imaginaires, et pt+1 est la mesure complexe subséquente à partir de pt. A partir de ces champs de déplacement, les longueurs d'onde élastiques sont alors estimées par ().

Nous souhaitons estimer la rigidité spatialement résolue d'un matériau à travers sa vitesse d'onde donnée par

où ρ est sa masse volumique et M est un facteur de module élastique. Cette forme générique s'applique aux : ondes de cisaillement, où \(M=\frac{1}{3}\mu\), avec μ le module de cisaillement ; Ondes P, où \(M=K+\frac{4}{3}\mu\), avec K le module de masse ; et les ondes de surface de Rayleigh, où \(M=\frac{{(0,862+1,14\nu )}^{2}}{2{(1+\nu )}^{2}}\mu\) avec ν la valeur de Poisson rapport. Comme pour toute onde progressive, la vitesse peut être exprimée par v = λf, où λ est sa longueur d'onde spatiale et f sa fréquence temporelle. Si f et ρ sont connus ou connus pour être fixes a priori, alors on peut calculer le module d'élasticité M directement à partir de λ mesuré.

En supposant des ondes de cisaillement, comme dans les réf. 29,31, et un matériau isotrope linéairement élastique, le module de Young peut être trouvé comme

Étant donné des ondes élastiques périodiques se propageant à travers un matériau hétérogène, on peut mesurer son déplacement à une position x comme

où a est l'amplitude de l'onde, λ est la longueur d'onde spatiale et ϕ(t) est une fonction de phase décrivant la position de l'onde à l'instant t. On peut également estimer la déformation locale comme une approximation par différence finie d'une dérivée comme

où Δx est la résolution du système d'imagerie. Etant donné que l'énergie d'une sinusoïde suffisamment échantillonnée est Nta2/2 quel que soit l'ordre des échantillons, il s'ensuit que λ peut être trouvé par

où \(\mathop{\sum }\nolimits_{t = 1}^{{N}_{t}}d{(t)}^{2}\) est l'énergie de déplacement d'une séquence de mesures d'ondes telles que représentées dans l'éq. (4). L'estimation dans l'éq. (6) est équivalent à celui présenté dans la réf. 29 et utilisé dans la réf. 30. L'estimation dans l'Eq. (6) est exacte dans un système sans bruit car Δx → 0 et le nombre d'échantillons temporels Nt → ∞. Dans ce cas, ϕ(t) peut prendre la forme ϕ(t) = kt, où k est un scalaire, ou une fonction aléatoire couvrant [ − π, π] avec une densité de probabilité uniforme. Par exemple, si l'on a un échantillonnage linéaire avec une gigue temporelle telle que ϕ(t) = kt + n avec \(n \sim {{{{{{{\mathcal{N}}}}}}}}(0,{ \sigma }_{t}^{2})\), puis Éq. (6) est toujours précis pour un nombre suffisant de mesures.

Bien que l'estimation de la longueur d'onde dans l'Eq. (6) est valable dans le cas sans bruit, il est fortement biaisé par tout bruit de phase en pratique. En effet, la longueur d'onde de cisaillement est de l'ordre du millimètre29,31, ce qui est bien supérieur à la résolution d'échantillonnage spatial en OCT, de sorte que tout bruit additif à large bande sera amplifié par le gradient dans Eq. (5).

Pour le bruit gaussien blanc additif (AWGN), \(n \sim {{{{{{{\mathcal{N}}}}}}}}(0,{\sigma }^{2})\), avec variance σ2, l'énergie du signal après filtrage avec un noyau h est

où Nh est la longueur de h. Par exemple, l'approximation du gradient de différence centrale dans l'équation. (5) revient à filtrer spatialement le vecteur de déplacement avec le noyau h = [ − 0,5, 0, 0,5]/Δx, qui a une énergie de En = 0,5σ2/Δx2. Si σ peut être estimé à partir des échantillons, alors on peut former l'estimation débiaisée de la longueur d'onde comme

où * désigne la convolution spatiale.

Alors que l'éq. (8) peut être raisonnable dans un bruit modérément faible, lorsque les énergies du bruit sont similaires aux énergies du signal, cela produira une variance élevée ou même des estimations indéfinies. Cela peut être compensé dans une certaine mesure en augmentant Ng ou Nt, mais au détriment du taux de réponse temporelle et du temps de balayage ou de la résolution spatiale dans la direction du gradient et ne contrôlera pas le numérateur qui devient négatif. Nous introduisons donc un filtre passe-bas 2D supplémentaire sur les vecteurs de déplacement. Cette estimation filtrée débiaisée comme

où g est le filtre passe-bas 2D, et Nh*g = Nh + Ng − 1 est la longueur du noyau du filtre de déformation efficace. Nous utilisons une fonction gaussienne 2D pour g car elle n'introduira aucun artefact d'ondulation, de taille Ng = ⌈2cg⌉ + 1, où cg est son écart type spatial de la gaussienne. Le filtre gaussien a généré un motif de chatoiement sur les cartes de contraste mécanique.

Malgré le filtrage et la réduction efficace de la puissance du bruit dans Eq. (9), il peut toujours y avoir des cas d'estimations indéfinies en raison d'une négativité potentielle. Pour éviter cela, nous adoptons une approche de «soustraction douce» telle qu'utilisée dans la correction de la diffusion par tomodensitométrie à rayons X39

qui remplace l'opération a − b, où γ est un facteur de compensation qui peut être calculé comme

où β = [0, 1] est un terme de seuillage que nous avons fixé à β = 0,9 dans ce travail. Dans nos expériences, cela ne commence à contribuer que très profondément dans les échantillons, où l'intensité est de toute façon trop faible pour une mesure fiable.

Une dernière considération pour cette méthode est la détermination de la variance du bruit σ2. Sous les hypothèses, cela varie dans l'espace et la longueur d'onde est nettement plus grande que la résolution spatiale du système OCT, elle peut être approchée comme la variance moyenne dans le temps dans une fenêtre glissante 3 × 3.

Au total, des hydrogels d'agarose à 1 %, 2 % et 3 % contenant 1 % de lait ont été fabriqués dans cette étude. En bref, de l'agarose de type I (Fisher Scientific, Royaume-Uni) a été ajouté à de l'eau distillée et passé à l'autoclave à 121 °C pour préparer des solutions d'agarose à 2 %, 4 % et 6 %. Une solution de lait à 2% a été préparée en dissolvant du lait en poudre écrémé en poudre (Bio-rad, Royaume-Uni) dans de l'eau distillée et cette solution a été mélangée avec un volume égal de solution d'agarose à 2%, 4% et 6% à 100 ° C et coulée dans un plat et on laisse solidifier à température ambiante pour produire des gels d'agarose à 1 %, 2 % et 3 % contenant 1 % de lait. Des gels hybrides à 2/3 % ont été fabriqués en grattant une partie du gel à 2 % et en ajoutant une solution d'agarose à 3 % dans la boîte et en les laissant se solidifier. Les gels ont ensuite été carottés à l'aide d'un poinçon à biopsie pour produire des disques de 6 mm de diamètre et de 2 mm d'épaisseur. Ces gels ont ensuite été placés dans une plaque de culture tissulaire à 96 puits avec 100 μL d'eau distillée couvrant la surface de chaque gel et imagés avec OCT pour la mesure de la longueur d'onde comme décrit précédemment.

Le module de Young de ces gels d'agarose a été testé en utilisant Bose ElectroForce 5500 (TA Instruments, UK). En bref, l'excès d'eau a été éliminé des gels d'agarose et une précharge de 0,01 N a été utilisée pour assurer un contact direct entre l'échantillon et les surfaces de la plaque. Une compression en rampe non confinée (jusqu'à 10 % de déformation de l'épaisseur de l'échantillon) a été effectuée et le module de Young a été calculé à partir de la courbe contrainte-déformation.

La patte arrière de mouton a été achetée dans un abattoir local et des cellules souches mésenchymateuses ovines (CSM) ont été isolées de la moelle osseuse du fémur. Ainsi, aucune approbation éthique n'a été nécessaire pour cette étude. Les MSC du deuxième passage ont été trypsinisées et 200 000 cellules ont été ajoutées dans chaque puits d'une plaque à 96 puits à fond en V (Greiner bio-one) et centrifugées pendant 5 min à 500 × g pour former des culots cellulaires.

Pour la différenciation chondrogénique, les culots cellulaires ont été cultivés dans un milieu de différenciation composé de DMEM riche en glucose additionné de 2 mM de L-glutamine, 100 U/mL de pénicilline-0,1 mg/mL de streptomycine, 100 μg/mL de pyruvate de sodium, 40 μg/mL de L- proline, 50 μg/mL d'acide L-ascorbique-2-phosphate, 4,7 μg/mL d'acide linoléique, 1,5 mg/mL d'albumine de sérum bovin (BSA), 1 × insuline-transferrine-sélénium, 100nM dexaméthasone (tous de Sigma-Aldrich, UK) et 10 ng/mL de TGF-β3 humain recombinant (Peprotech, UK) pendant 3 semaines, le milieu étant échangé trois fois par semaine. Au cours de cette période de différenciation, la moitié des granulés ont été soumis à une pression hydrostatique (HP, 270 kPa, 1 Hz, 1 h/jour) pour améliorer la différenciation, tandis que le reste n'a pas été stimulé et est resté témoin. Les groupes contrôle et HP ont été récoltés à la fin de la période de différenciation et imagés avec OCT pour la mesure de la longueur d'onde. Les échantillons ont ensuite été digérés avec de la papaïne pour mesurer leur teneur en glycosaminoglycanes (GAG) à l'aide d'un test de liaison au colorant bleu de diméthylméthylène. Des échantillons ont également été récoltés pour l'histologie, incorporés à la cire, sectionnés et colorés avec 1 % de bleu alcian 8GX dans du HCl 0,1 M pour la distribution des GAG.

Pour la différenciation ostéogénique, les culots cellulaires ont été cultivés dans un milieu de différenciation constitué de DMEM à faible teneur en glucose additionné de 10 % de sérum bovin fœtal, 2 mM de L-glutamine, 100 U/mL de pénicilline-0,1 mg/ml de streptomycine, 100 nM dexaméthasone, 50 μM L -acide ascorbique-2-phosphate et β-glycérco-phosphate 10 mM (tous Sigma-Aldrich, Royaume-Uni) pendant 3 semaines, le milieu étant échangé trois fois par semaine. Au cours de cette période de différenciation, les échantillons ont été surveillés en continu à l'aide d'OCT de manière stérile pour la mesure de la longueur d'onde aux jours 3, 10 et 21, des échantillons séparés en culture parallèle étant terminés pour les tests mécaniques et l'histologie aux mêmes moments. Le module de Young des pastilles de cellules ostéogéniques a été testé à l'aide d'un appareil personnalisé conçu pour tester les microsphères et les organoïdes cellulaires40. Après avoir éliminé l'excès d'eau, des pastilles cellulaires ont été plaquées entre deux surfaces de plateau et une compression en rampe non confinée (jusqu'à 25 % de déformation du diamètre de l'échantillon) a été effectuée et le module de Young a été calculé à partir de la courbe contrainte-déformation. Pour l'analyse histologique, les culots cellulaires ont été inclus dans de la cire, sectionnés et colorés avec du rouge picrosirius pour l'accumulation de collagène.

Des matrices de collagène/fibroblaste ont été créées en utilisant la méthodologie décrite dans Timpson et al.41. Les matrices ont été incubées à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 15 jours pour permettre à la matrice collagène/fibroblaste de se contracter. La matrice collagène/fibroblaste a été imagée en utilisant l'OCT aux jours 1, 4, 7, 11 et 15 de la contraction de l'échantillon.

En utilisant le protocole décrit dans Hallas-Potts et al.42, une matrice de collagène/fibroblaste avec A2780 cultivé sur le dessus et une matrice vierge de collagène/fibroblaste sans cellules cultivées sur le dessus ont été préparées et transférées sur une grille métallique. Le déplacement de la matrice de collagène sur la grille est référé au jour 0. Les boîtes ont été incubées à 37 ° C avec 5 % de CO2 pendant 7 jours pour permettre aux cellules d'envahir. Les matrices collagène/fibroblaste ont été imagées les jours 2 et 7.

Immédiatement après l'imagerie OCT, la matrice a été retirée de la grille et ajoutée à un tube Falcon avec 5 ml de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % (p/v) pour fixer pendant la nuit. La matrice fixe de collagène/fibroblaste a été incluse dans de la cire, sectionnée et colorée avec de l'hématoxyline et de l'éosine (H&E) par le CRUK Edinburgh Centre Pathology & Phenomics Lab. Les sections colorées ont été imagées sur le modèle Nanozoomer XR, les données capturées à l'aide du scan NDP v 3.1. Grossissement ×40.

Des yeux de porc fraîchement énucléés ont été achetés chez le boucher local. Pour induire une lésion cornéenne, un poinçon de biopsie de 5 mm a été utilisé pour faire une coupe partielle dans la cornée centrale à une profondeur d'environ 50 %. Ensuite, une solution de fibroïne de soie méthacrylée (15 ou 20 % en poids) contenant 0,5 % (p/v) de phényl-2,4,6-triméthylbenzoylphosphinate de lithium (LAP) a été remplie jusqu'au défaut et photoréticulée pendant 5 min (365 nm, 3mW/cm2). La cornée fraîche, la cornée blessée et l'hydrogel de fibroïne de soie réparée ont ensuite été imagées avec l'OCT pour la mesure de la longueur d'onde comme décrit précédemment. Le module de stockage (G) d'hydrogels Silk-MA fraîchement préparés a été mesuré en mode oscillatoire à 32 ° C en utilisant une géométrie plaque-plaque (Kinexus Pro +, Malvern, Royaume-Uni). Après avoir exécuté un balayage d'amplitude pour déterminer la plage viscoélastique linéaire (LVER), un balayage de fréquence a été effectué à une contrainte de cisaillement de 0,5 %. Les expériences ont été menées en triple.

Pour démontrer le concept d'élastographie vibrationnelle, un ensemble de simulations FEM a été exécuté, comme résumé à la Fig. 6. Cela a été réalisé avec code_aster43 sur un maillage contenant une plaque de polystyrène à 24 puits et un gel hétérogène avec une charge dynamique appliquée axialement à un coin. de la plaque. Il y avait 36 ​​000 nœuds au plan central du gel avec une épaisseur de 2 mm et un diamètre de 10 mm, dont les positions ont été échantillonnées toutes les 10 μs sur un temps de simulation total de 5 ms. Le signal de charge utilisé pour la stimulation était \(\sin (2\pi ft)/t\), où f = 2 kHz, avec le coin opposé fixé comme condition limite - d'autres combinaisons de charges ont également été testées avec des champs de déplacement résultants similaires et estimations.

a Montre le gel posé sur la base d'un puits. b Affiche les amplitudes de déplacement de la plaque à t = 2 ms et t = 4 ms. c Montre la force d'excitation appliquée à un coin de la plaque : une sinusoïde de 2 kHz avec une amplitude décroissante de façon exponentielle. d Montre un exemple des déplacements différentiels dans la direction axiale au centre du gel. e Affiche la longueur d'onde estimée sur la surface du gel et la vérité terrain en supposant des ondes de cisaillement de 2 kHz. Panneau f sont des tracés de profil sont les lignes indiquées en e.

Les longueurs d'onde de toutes les ondes élastiques résultantes dans ce cas sans bruit ont été estimées à l'aide de l'équation. (6). Tout d'abord, les positions axiales à chaque instant ont été rééchantillonnées sur une grille polaire avec origine au centre du gel afin que les déformations soient estimées le long des sections efficaces telles qu'utilisées dans la section expérimentale. L'estimation de l'éq. (6) a été appliqué aux 400 champs de déplacement (position différentielle) entre t = [1, 4] ms. Enfin, ces longueurs d'onde ont été rééchantillonnées sur une grille cartésienne pour former une image.

Nous utilisons une variante de méthode de bord Blonski44 également adoptée par la réf. 31 pour la résolution spatiale : premier ajustement de la fonction sigmoïde

avec l'algorithme de Levenberg-Marquardt pour les paramètres (L, k, x0, C) puis en trouvant la pleine largeur à mi-hauteur (FWHM) de la dérivée sigmoïde, qui peut être exprimée comme

Nous avons utilisé une ANOVA unidirectionnelle suivie d'un test de Tukey-Kramer dans Matlab (The Mathworks) pour tester les différences significatives avec des valeurs de p <0,01 ou <0,05 et un nombre d'échantillons N > 3.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les ensembles de données de tomographie par cohérence optique générés pendant et/ou analysés pendant l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable. L'ensemble de données de mesures derrière les bargraphes peut être trouvé sur figshare. https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22148093.v3.

Les codes matlab pour implémenter les algorithmes décrits dans cet article sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Nous tenons à souligner le soutien d'un prix ERC Advanced à l'AJEH ; 638836 : H2020_ERC_DYNACEUTICS et le Hub MRC UKRMP Engineering the Cell Environment.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Jonathan H. Mason, Lu Luo.

MRC Centre for Regenerative Medicine, Université d'Édimbourg, Édimbourg, Royaume-Uni

Jonathan H. Mason, Amelia Hallas-Potts, Vlastimil Srsen & Pierre O. Bagnaninchi

Institut de technologie de la santé, Université de Birmingham, Birmingham, Royaume-Uni

Lu Luo et Alicia J. El Haj

Département d'ingénierie, Nottingham Trent University, Nottingham, Royaume-Uni

Yvonne Reinwald

Institut de mathématiques, Université d'Oxford, Oxford, Royaume-Uni

Matteo Taffetani & Sarah Waters

Cancer Research UK Edinburgh Centre, Université d'Édimbourg, Édimbourg, Royaume-Uni

Amelia Hallas-Potts & C. Simon Herrington

MRC Centre for Reproductive Health, Université d'Édimbourg, Édimbourg, Royaume-Uni

Chih-Jen Lin

École de génie chimique, Université de Birmingham, Birmingham, Royaume-Uni

Inês A. Barroso, Zhihua Zhang, Zhibing Zhang et Anita K. Ghag

Institut des sciences et technologies en médecine, Université Keele, Stoke-on-Trent, Royaume-Uni

Ying Yang

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JHM, LL, YR, YY, SW, AJEH et PB ont conçu l'étude, les expériences et rédigé l'article. JHM a écrit l'algorithme. JHM et LL ont acquis des scans OCT. JHM, LL, YR, MF, AHP, VS, CJL, IAB, ZZ et AKG ont réalisé les expériences. JHM, LL, CSH, AJEH et PB ont analysé les données.

Correspondance à Alice J. El Haj ou Pierre O. Bagnaninchi.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Stefan Catheline et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef principaux : Alexander Cartagena-Rivera, Anam Akhtar et Christina Karlsson Rosenthal.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Mason, JH, Luo, L., Reinwald, Y. et al. Élastographie par cohérence optique des vibrations ambiantes débiaisées pour profiler les propriétés mécaniques des cellules, des organoïdes et des tissus. Commun Biol 6, 543 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04788-0

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Reçu : 13 septembre 2021

Accepté : 31 mars 2023

Publié: 18 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04788-0

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